E43 · 单粒子重建

单粒子冷冻电镜：从电影到三维图

更多粒子，能补回缺失的观察方向吗？ 补不回来。平均更多粒子图像能降低噪声，可第三维的信息只能来自不同方向的投影。某个朝向的粒子一个都没有，这个方向就一直缺着，加多少粒子都没用。

从计数微图找颗粒，估计 CTF 后重建三维图。比较离焦用错、误拾取、参考受限和真正缺少观察方向时，图像会怎样出问题。

由计数功率谱估计的离焦 $\text{—}$

由图像拾取的候选数 $\text{—}$

接收粒子窗口 $\text{—}$

观察法线特征值比 $\text{—}$

更多测量与实验目标

重建所用离焦 $\text{—}$

功率谱拟合与备选的差距 $\text{—}$

所用光学参数的额外失配 $\text{—}$

所选窗口状态 $\text{—}$

存储粒子电影 $\text{—}$

记录电子事件 $\text{—}$

存储电影剂量 $\text{—}$

所选粒子，从一计数 $\text{—}$

推断观察方向数 $\text{—}$

所选参考相关 $\text{—}$

目标函数终值与初值之比 $\text{—}$

半图一致性，第四壳 $\text{—}$

实验目标 $\text{—}$

预设为模拟示例；各图标题注明数据来源。

拾取阈值，噪声标准差倍数

s_{\min}

4.5

估计后使用的离焦偏差

\delta f

0\,\mu m

参考库：0 多方向，1 单一方向

0

每粒子电影总剂量

D

40\,e^{-}/\mathring A^2

独立粒子数

N

96

下一次采集欠焦

\Delta f

1.5\,\mu m

进阶设置

非晶支撑膜纹理振幅

1

重建切片索引，各物体坐标轴

8

示意冰厚

t

60\,nm

强制单一观察方向的粒子

0\,\%

保留结构的粒子比例

100\,\%

帧漂移尺度，整数位移

1\,\mathrm{pixel}

指定第二团块振幅

1

计数：0 期望，1 有种子统计

1

所选记录粒子

j

50\,\%

仅显示对比增益

G

1

学习目标与模型边界

用带噪声的图像重建粒子

补齐缺失视角

目标：至少接收六十四个图像候选，覆盖十个方向。候选通过筛选的比例至少百分之六十五，所用 CTF 要与计数功率谱相容。使用薄冰和适中的剂量。

先采集完整视野电影，再估计 CTF、寻找候选并重建。处理参数使用存下的计数。点击候选圆圈可以排除它；拖动冰面手柄会重新采集。

四帧完整视野保留原始像素。运动位移和显微镜标定已知，颗粒位置与离焦从图像估计。CTF 纹理来自已知的非晶支撑条带。取向仍用固定宽化参考匹配；密度从零开始求解。

采样网格间距为 0.8 纳米，不代表原子分辨率。所选三维切片是数据处理的结果，不属于仪器本身。仪器和粒子按不同的示意倍率绘制。

模型假设

这是合成的弱相位教学模型。粒子是一个四叶团块，放在十六体素网格上，从十二个观察方向、两个面内角度成像。四帧完整视野保留原始计数。整像素运动、像素间距和计数归一化作为标定给出，颗粒位置从图像寻找。离焦从已知非晶支撑条带的功率谱拟合，只比较 0.5 至 3 微米的欠焦支路。白纹理功率谱、标量 CTF、有限网格和教学阈值都限制这个估计。取向仍靠给定的宽化参考匹配。单颗粒反演使用补边后的有限窗口，忽略远处粒子和支撑膜的弱贡献。玻璃化、冰层衰减和剂量损伤只是示意。两个半图共用参考和标定，它们的一致性不能当作金标准分辨率认证。这里不做原子解释，也不含多重散射、探测器调制传递、连续取向搜索和构象分类。

先抓重点

核心问题: 更多粒子，能补回缺失的观察方向吗？
一句话直觉: 独立粒子越多，噪声越小；第三维却要靠不同方向的视图来确定。

核心数学模型

弱相位近似下的期望计数

\begin{aligned}S&=\sum_j T_{r_j}P_{R_j}\rho+\eta\\\mathbb E[C_f]&=b[1+aT_{s_f}(H*S)]\end{aligned}

CTF 先作用于粒子与支撑膜组成的完整视野，再逐帧平移、计数。运动和计数归一化已标定，离焦留到之后估计。

电子光学相位

\chi(q)=\pi\lambda\Delta f\,q^2-\frac{\pi}{2}C_s\lambda^3q^4

欠焦取正值，空间频率以每纳米周期数计。损伤包络是设定的示意衰减。

从计数纹理功率估计 CTF

P(q)\approx a_t|H(q)|^2+b_n

支撑膜的计数功率谱与非负纹理功率、噪声功率共同拟合。CTF 包含正弦相位反差、设为 0.1 的振幅反差和指定剂量包络。欠焦支路预先已知，拟合差距阈值只是教学判据。

由记录计数重建

\begin{aligned}\widehat\rho&=\arg\min_{\rho\geq0}\sum_j\|HP_{\widehat R_j}\rho-y_j\|^2\\&\quad+\alpha\|\rho\|^2\end{aligned}

求解用投影梯度法，保持密度非负，用的是同一个离散投影算子及其精确转置。参考只提供取向，不往图里添加密度。

共用参考下的半图一致性

F_s=\frac{\operatorname{Re}\sum_{k\in s}V_1(k)\overline{V_2(k)}}{\sqrt{\sum_{k\in s}|V_1(k)|^2\sum_{k\in s}|V_2(k)|^2}}

候选按拾取顺序交替分到两半，再匹配参考。两半共用同一个低分辨率参考和标定，所以一致性既不证明方向覆盖完整，也不证明绝对分辨率。

常见难点

重建图不是原子结构

容易误解重建出来的图就是蛋白质的原子结构。

正确理解这是合成的弱相位教学模型。粒子是一个四叶团块，放在十六体素网格上，从十二个观察方向、两个面内角度成像。四帧完整视野保留原始计数。整像素运动、像素间距和计数归一化作为标定给出，颗粒位置从图像寻找。离焦从已知非晶支撑条带的功率谱拟合，只比较 0.5 至 3 微米的欠焦支路。白纹理功率谱、标量 CTF、有限网格和教学阈值都限制这个估计。取向仍靠给定的宽化参考匹配。单颗粒反演使用补边后的有限窗口，忽略远处粒子和支撑膜的弱贡献。玻璃化、冰层衰减和剂量损伤只是示意。两个半图共用参考和标定，它们的一致性不能当作金标准分辨率认证。这里不做原子解释，也不含多重散射、探测器调制传递、连续取向搜索和构象分类。

共用参考，一致性能说明的有限

容易误解壳相关很高，图在每个方向上就都对。

正确理解两半共用同一个设定的低分辨率参考和同一个标定传递函数。这里不做联合精修，也不声称满足金标准的独立性。拒绝的粒子和所有推断出的观察方向都会列出，但不给出由 FSC 推得的分辨率。

动手实验

01
采集电影
先查看默认微图和候选圆圈，再采集新的完整视野电影。展开数据行可查看第一帧原始计数。
你会看到： 每个粒子有四帧带噪声的图像；改动采集参数，这些计数不会变。
02
校正并分组
先对照计数功率谱和 CTF 拟合，再点击圆圈排除或恢复候选。随后比较未校正窗口、校正窗口和给定参考。
你会看到： 匹配给每个粒子选出二十四个离散取向中的一个；被拒绝的窗口仍然看得到。
03
求解三维图
查看重建的三个正交切片，看数据目标函数怎样下降。
你会看到： 每个体素都由记录下的对比经投影算子求出。
04
检验一致性
比较默认示例和“更多粒子，单一方向”。再分别尝试离焦不匹配、误拾取和参考方向受限，查看问题出在推断的哪一步。
你会看到： 即使所有接收的粒子都只从一个方向观察，两个半图仍可以高度一致。